Apoptos och nekros i de cirkumventrikulära organen efter experimentell subaraknoidal blödning som upptäckts med annexin V och kaspas 3-immunfärgning
Syften: De cirkumventrikulära organen (CVO)
stark> är avgörande för de flesta autonoma och endokrina funktioner. Trauma och blödningar kan påverka deras funktion. Syftet med denna studie var att undersöka apoptos och nekros i CVOs under den tidiga perioden efter experimentell subaraknoidal blödning (SAH) hos råttor, med annexin V-affinitet och kaspas 3-immunfärgning.Metoder: Tre experimentella grupper användes: Dag 1 och 2 efter SAH, och en kontrollgrupp, vardera sju Wistar-albinoråttor. Subaraknoidalblödning åstadkoms genom transklival basilarartärpunktion. Råttor perfunderades med 0,9 % NaCl och 0,1 M fosfatbuffert pH 7,4 tills hjärtstopp. Apoptos och nekros i CVO mättes med flödescytometri med annexin V-färgning och med kaspas 3-immunfärgning.
Resultat: Apoptos i organum vasculosum lamina terminalis (OVLT) , median eminens (ME), och area postrema (AP) var signifikant högre i dag 1-gruppen än i kontrollgruppen. Apoptos i det subforniciala organet (SFO), OVLT, ME och AP var signifikant högre i dag 2-gruppen än i kontrollgruppen. Det fanns signifikanta skillnader mellan dag 1- och dag 2-grupperna, förutom för AP. Nekros i SFO och OVLTvar signifikant högre i dag 2-gruppen än i dag 1 eller kontrollgrupper, medan nekros i ME och AP inte skilde sig mellan de tre grupperna . Kaspas 3-positiv celltäthet var mer intensiv i dag 2-gruppen än i dag 1- och kontrollgrupperna.
Diskussion: Förebyggande av apoptos kan potentiellt förbättra försämrade funktioner hos CVO efter SAH.
Introduktion
Apoptos är programmerad celldöd, som förändras under patologiska tillstånd som subaraknoidal blödning (SAH) .1 Apoptos tros vara en bidragande faktor till patogenesen av tidig hjärnskada,2 vasospasm,3 och hjärninfarkterna4 som ses efter SAH. I litteraturen finns rapporter om apoptos1,2,5,6 och nekros7,8 efter SAH, och förbättringar av dessa efter administrering av apoptoshämmare.5,6 Studier har visat d att hämning av apoptotiska vägar efter SAH inte bara minskade celldöd
utan också resulterade i en signifikant förbättring av funktionellt resultat,2,4 och därmed kan ha undertryckt många av de sekundära skadorna i samband med SAH.1
Förutom många värdefulla centra i hjärnan, finns ett antal sensoriska cirkumventrikulära organ (CVO), såsom det subforniciala organet (SFO) , organum vasculosum lamina terminalis (OVLT), area postrema (AP) och medianeminensen (ME, en sekretorisk CVO), påverkas av SAH. strong>9,10 Circumventrikulära organ är rika på neurotransmittorer och saknar en blod-hjärnbarriär.11,12
Annexin V har visat sig interagera starkt och specifikt med fosfatidylserin, och kan således användas för att upptäcka tidig apoptos.15 Kaspas 3-immunfärgning är en annan metod som för närvarande används för att detektera apoptos i vävnadsprover.16
I denna studie undersökte vi förekomsten av tidig och sen apoptos/nekros genom annexin V-affinitet och kaspas 3-immunfärgning i CVO efter experimentell SAH på råttor. I vår genomgång av litteraturen lyckades vi inte hitta någon tidigare rapport som behandlade detta ämne.
Material och metoder
Studieprotokollet godkändes av Bu ¨lent Ecevit University Animal Ethics Committee.
Experimenten utfördes vid Experimental Surgery, Research and Animal Laboratory vid Bu¨lent Ecevit University, fakulteten för medicin, Zonguldak, Turkiet. Totalt ingick 21 vuxna Wistar-albinoråttor av hankön, som vägde 200–300 g, i studien. Alla råttor hölls vid 22–25uC med lämplig luftfuktighet, i en 12/12 timmars ljus/mörkercykel, och fick vätska och mat ad libitum. Råttorna delades in i tre grupper enligt följande: Dag 1 efter SAH (n 5 7), Dag 2 efter SAH (n 5 7) och kontroller (n 5 7). >
Råttor bedövades genom intraperitoneal injektion av ketamin (60 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg). Experimentell SAH utfördes med en teknik som liknar den som beskrivs av Barry et al.,17 som har beskrivits tidigare.9,10
I korthet gjordes ett cervikalt snitt i mittlinjen i ryggläge under en operation mikroskop (Takagi OM-5, Japan), och clivus exponerades med den främre parafaryngeala metoden. En benig vind w framför basilarartären skapades med hjälp av nålar med stor borrning, varvid man var extremt noga med att inte öppna prepontincisternen. En suturnål med en ytterdiameter på 75 mm (Ethicon, Livingston, Storbritannien) sattes in i basilarartären. Utdragning av nålen orsakade omfattande blödningar i subarachnoidutrymmet, med en jämn fördelning upp till luktområdet. Råttorna hölls vid liv i 1 och 2 dagar efter SAH under lämpliga förhållanden.
Råttorna avlivades genom perfusion. Under narkos utfördes torakotomi, sedan kanylerades den vänstra kammaren, den nedåtgående aortan klämdes fast, det högra förmaket snittades och blodet tvättades från huvudet och livmoderhalsen med 0,9 % NaCl och 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4) tills hjärtat stannade. Djuren halshöggs och prover av SFO, OVLT, ME och AP erhölls med en stereotaktisk råttatlas (Paxinos & Watson).
Principen för annexin V-metoden är att mäta med flödescytometri affiniteten av annexin V till fosfatidylserin, som translokeras från plasmans inre membran till det yttre broschyret under
apoptos.15 Celler skördades från de olika CVO
. starka >s separat. Vi använde 100 ml cellsuspension för varje prov. Annexin V konjugerat med fluoresceinisotiocyanat (FITC)-färgade apoptotiska celler i närvaro av propidiumjodid (PI). Denna reaktion möjliggör detektering av fosfatidylserin på ytan av apoptotiska celler. Både PI-positiva och annexin V-positiva celler indikerade procentuell nekrotisk status. Vi använde ett kommersiellt annexin-FITC-kit (Beckman-Coulter, Fullerton, CA, USA) i enlighet med tillverkarens instruktioner och en Coulter FC500 > > flödescytometer (Beckman-Coulter). En schematisk presentation av förlusten av membranlipidasymmetri under tidig apoptos och annexin V-specifik bindning till fosfatidylserin visas i fig. 1. PI-positiva och annexin V-positiva celler indikerar sen apoptos eller nekros (Fig. 1).För histopatologisk och immunhistokemisk analys, CVO Erhållna från råtthjärnorna användes för alla grupper. Cirkumventrikulära organprover från varje råtta fixerades i 10 % neutral formalinlösning och bäddades sedan in i paraffinvax. Sektioner skars på en kryostat vid 5–6 mm tjocklek Vävnadssektioner avvaxades sedan och färgades med hematoxylin och eosin (H&E) och kresylviolett för histomorfologisk analys. Circumventrikulära organ utvärderades under ljusmikroskopi av en enda patolog(FB)blind för studiegrupperna. Immunhistokemisk analys med användning av den polyklonala antikroppen antikaspas 3 (CPP32) (Neomarkers, Cat #RB-1197R7, Fremont, CA, USA) utfördes också för att utvärdera apoptos. Immunfärgning baserades på streptavidinbiotinperoxidaskomplextekniken med mikrovågsantigenåtervinning med användning av formalinfixerade paraffinvaxinbäddade vävnader. Vaxinbäddade sektioner uppsamlades på objektglas och avvaxades sedan och återhydrerades. Efter avvaxning behandlades sektioner med 10 % väteperoxidas i filtrerat vatten för att blockera endogen peroxidasaktivitet. För antigenåtervinning kokades objektglasen med 10 mmol/L citratbuffert (pH 7) i 10 minuter i en mikrovågsugn. Objektglasen inkuberades sedan med primära antisera, inklusive kaspas 3 polyklonal kaninantikropp (Neomarkers, Cat #RB1197-R7, Fremont, CA, USA). Efter tvättning i fosfatbuffrad saltlösning inkuberades vävnaderna på objektglasen med en biotinkonjugerad sekundär antikropp, följt av inkubation i streptavidinbiotinsystemkomponenterna under 30 minuter vid rumstemperatur. Reaktionerna blev synliga efter nedsänkning av proverna i 3,39-diaminobensidintetrahydroklorid (DAB; Lab Vision, Fremont, CA, USA). Efteråt motfärgades sektionerna med hematoxylin, sköljdes sedan och monterades. Den negativa kontrollen hade den primära antikroppen utelämnad och tonsillvävnad användes som positiv kontroll. Kaspas 3-immunreaktivitet observerades huvudsakligen i cytoplasman med viss nukleär färgning. Objektglasen utvärderades på ett förblindat sätt av en enda patolog (FB). Apoptos, mätt med kaspas 3-positiv celltäthet, utvärderades i CVO:erna för varje grupp.
Statistisk analys
Statistiska paketet för samhällsvetenskaper (version 19.0; SPSS Inc, Chicago, IL, USA) användes för alla dataanalyser. Resultaten uttrycktes som median och intervall. Shapiro–Wilk-testet användes för normalitetstestning för variabler utan normalfördelning, och Kruskal–Wallis-testet användes för jämförelser mellan de tre grupperna. Conover-testet var används för post hoc jämförelser. För alla statistiska jämförelser ansågs 0,05 statistiskt.
Resultat
Flödescytometriska fynd sammanfattas i tabell 1. Grafik erhållen från PI/annexin signifikant V flödescytometrianalys av SFO, OVLT, ME och AP (kontroll- och dag 2-grupper) ges i fig. 2. I dag 1-gruppen var de tidiga apoptosresultaten, visade som median (intervall), följande: OVLT 0,50 % (0,08–1,89), ME 0,55 % (0,21–0,84) och AP 0,46 % (0,20–1,86), apoptos iSFO skilde sig inte signifikant från det i kontrollgruppen. För dag 2-gruppen var tidig apoptos som följer: SFO 1,88 % (0,97–2,99), OVLT 1,85 % (0,77–3,16), ME 0,79 % (0,54–1,43) och AP 0,82 % (0,19–1,49) ). ), vilket var signifikant högre i alla fyra områdena än i kontrollgruppen. I kontrollgruppen var tidig apoptos0,12 % (0,02–0,35) i SFO, 0,15 % (0,04–0,71)i OVLT, 0,18 % (0,09–0,34) > i ME, och 0,06 % (0,01–0,24) i AP.
Nekros i SFO och OVLT i dag 2-gruppen var signifikant högre än i både dag 1 och kontrollgrupperna, och resultaten för ME och AP skilde sig inte mellan dag 1 och kontrollgrupperna
Histopatologisk undersökning av SFO, OVLT, ME, och AP-sektionerna uppvisade mer framträdande cellförlust i dag 2-gruppen än i de andra grupperna.
Caspas 3-positiv celltäthet var mer intensiv i dag 2-gruppen än i de andra två grupperna. Det fanns få kaspas 3-positiva celler i kontrollgruppen, och dag 1-gruppen hade färre kaspas 3-positiva celler än dag 2-gruppen.
Diskussion
Apoptos är en av mekanismerna i utvecklingen av celldöd, som kan ses efter klinisk och experimentell SAH.
I denna studie av CVO efter experimentell SAH, på råttor, sågs apoptos i SFO, OVLT, AP, och ME. I studiegruppen dag 1 fann vi ökad annexin V-affinitet till fosfatidylserin (tidig apoptos)i alla CVO förutom SFO. På dag 2 g
Läs: 0
